EcoRV ist ein Restriktionsenzym aus dem Bakterium Escherichia coli.
Eigenschaften
EcoRV ist eine Endonuklease (Typ II, Subtyp P), die DNA an einer palindromischen DNA-Erkennungsequenz schneidet. In suboptimalen Pufferbedingungen sinkt die Affinität von EcoRV zu der Erkennungssequenz und die DNA wird unspezifisch geschnitten (Star-Aktivität). Durch den Schnitt der DNA durch EcoRV entsteht ein blunt end (Ende ohne Überhang) und je einer Phosphatgruppe an beiden 5'-Enden der doppelsträngigen DNA-Produkte. EcoRV wird weder durch eine DAM-Methylierung, noch durch eine DCM- oder eine CpG-Methylierung gehemmt. Nach einer Restriktion von DNA in vitro kann EcoRV durch 20-minütiges Erhitzen auf 80 °C denaturiert und somit inaktiviert werden. Eco32I ist ein Isoschizomer von EcoRV und kann alternativ verwendet werden. Meistens wird EcoRV als rekombinantes Protein in E.coli hergestellt.
Struktur
EcoRV besitzt am N-Terminus eine Dimerisierungs-Proteindomäne, bestehend aus einer kurzen α-Helix, einem zweisträngigen antiparallelen β-Faltblatt und einer langen α-Helix. Sie bindet – wie alle typischen Endonukleasen des Typs II – als Homodimer an die DNA. Die DNA wird beim Schneiden an der Schnittstelle zwischen den Basen Thymin und Adenin in einem Winkel von 50° gebogen, was einzigartig unter den Endonukleasen des Typs II ist. Nach einem Gleiten der EcoRV entlang der DNA werden die äußeren Nukleinbasen erkannt und anschließend das Vorhandensein der zentralen und vergleichsweise kleinen Basen TA geprüft, die für eine Biegung der DNA notwendig sind.
Anwendungen
EcoRV wird für Restriktionsverdaue im Rahmen von Klonierungen oder Restriktionsanalysen verwendet.
Einzelnachweise
